Kontrastierverfahren: Vom Hellfeld zum Dunkelfeld


Kontrastierverfahren: Vom Hellfeld zum Dunkelfeld


Wie bei allen bildgebenden Verfahren spielt die Art der Beleuchtung des Präparates die entscheidende Rolle bei der Erzeugung des mikroskopischen Bildes. Für jede Art von Präparat ist ein eigenes Kontrastierverfahren notwendig, mit dem das Mikroskop einen optimalen Bildkontrast erzeugt.
Die Durchlicht-Hellfeldmikroskopie gleicht dem Durchleuchten eines Dias in einem Projektor: Verschiedene Bereiche des Präparates schwächen das Licht auf unterschiedliche Weise und absorbieren zusätzlich noch unterschiedliche Spektralbereiche. Hierzu sind allerdings ausreichend gefärbte Präparate notwendig, was insbesondere bei der Untersuchung von Erythrozyten schwierig wird: es würde zum Tod der Zellen führen. Dieser Ansatz ist für die Untersuchung von Nativpräparaten also grundsätzlich nicht geeignet.
Ein Ansatz zur Sichtbarmachung eigentlich unsichtbarer Strukturen ist die 1930 von Frits Zernike erfundene Phasenkontrast-Mikroskopie. Das Mikroskop enthält eine Einrichtung, mit der die durch die unterschiedlichen Brechungsindizes von Zellen und umgebendem Medium optisch in Hell-Dunkel-Kontraste umgewandelt werden können.

Höchsten Kontrast erhält man allerdings mit einem Dunkelfeldmikroskop. Diese Technik beruht darauf, dass durch eine spezielle Konstruktion des Kondensors verhindert wird, dass das Licht nach dem Durchstrahlen des Präparates direkt in das Objektiv fällt. Der Kondensor formt das Licht so, dass es das Präparat als Hohlkegel trifft. Ohne Präparat sieht man dann durch das Okular nichts, das Sehfeld ist im wahrsten Sinne des Wortes „dunkel“. Hierzu muss der Kondensor so aufgebaut sein, dass die Beleuchtungsstrahlen unter einem extrem flachen Winkel das Präparat treffen. Für Abbildungsmaßstäbe bis etwa 40:1 reicht dafür eine in die hintere Brennebene des Kondensors eingebrachte Ringblende aus (Abb. 3). Für sehr hohe Aperturen (NA > 1) sind Dunkelfeldkondensoren üblicherweise als Spiegelsysteme aufgebaut, die nach ihrer geometrischen Form als Kardioid-Kondensor bezeichnet werden (Abb. 3). Diese Kondensoren sind dann auch ausschließlich für die Dunkelfeldmikroskopie geeignet, Hellfelduntersuchungen sind nicht mehr möglich. Mit einem Kardioid-Kondensor können numerische Aperturen von NA = 1,4 erreicht werden.

Dunkelfeldkondensor mit Ringblende und Kardioidsystem
 
Abb. 3: Dunkelfeldkondensor mit Ringblende (links) und Kardioidsystem (rechts).

Jedes Objekt innerhalb des Präparates führt dazu, dass Licht durch Brechung, Streuung und Beugung in das Objektiv gelangt. Es werden also ausschließlich Objektstrukturen sichtbar, die von einer ebenen Fläche abweichen, also Kanten, Ränder usw.
Auch an das Objektiv werden besondere Anforderungen gestellt. Da das Kontrastierverfahren darauf beruht, dass kein direktes Licht beobachtet wird, muss die NA des Objektivs prinzipiell kleiner als die des Kondensors sein. Hierzu ist es notwendig, im Objektiv eine Irisblende vorzusehen, mit der eine optimale Einstellung des Dunkelfeldbildes möglich ist (Abb. 4). Wird sie geschlossen, verschwindet allmählich der Streulichthintergrund, und das mikroskopische Bild wird kontrastreicher.

Abb. 4: Objektiv Plan 100/1,25 – 0,60 Oel mit Irisblende.

Objektiv Plan 100/1,25

In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, dass alle auf den ersten Blick sehr günstigen Dunkelfeldmikroskope mit Kondensoren mit numerischen Aperturen von höchstens NA = 1,25 ausgestattet sind. Allerdings ist sie damit gerade einmal gleich der NA des Objektivs – üblicherweise ein 100/1,25 – 0,60 Oel mit Irisblende. Das hat stets zur Konsequenz, dass die NA des Objektivs durch Schließen der Irisblende weit verringert werden muss, um den Kontrast ausreichend zu steigern. Dadurch wird jedoch ein großer Teil des Auflösungsvermögens dieses hochaperturigen Objektivs verschenkt – feine Strukturen im Blutplasma sind damit kaum zu erkennen. In diesem Zusammenhang sei weiter angemerkt, dass ein Hersteller sogar ein Dunkelfeldmikroskop anbietet, dessen 100:1-Objektiv völlig ohne Irisblende auskommt. Das mache angeblich die Handhabung einfacher und gewährleiste eine hohe Bildqualität. Vor dem hier beschriebenen technischen Hintergrund erscheinen diese Argumente vergleichsweise zweifelhaft…

Vergleich:
Ein ölimmergierter Kondensor mit NA = 1,25 emittiert einen Lichtkegel mit einem Öffnungswinkel von 112°. Im Gegensatz dazu beträgt für NA = 1,4 der Öffnungswinkel bereits 138°.

Ein gezielt zur Anwendung in der Nativblut-Analyse entwickeltes Dunkelfeldmikroskop zeigt Abb. 5. Das optische System besteht aus dem erwähnten Kardioid-Dunkelfeldkondensor mit NA = 1,4 und zwei Objektiven: ein Achromat 10/0,25 dient zur Zentrierung des Kondensors, das Plan 100/1,25 – 0,60 Oel zur eigentlichen Beobachtung des Nativblut-Präparates. Mit einem Okularpaar mit 10¬facher Vergrößerung wird eine Gesamtvergrößerung von 1000x erreicht. Ein weiteres wichtiges Ausstattungsmerkmal ist die Kaltlichtbeleuchtung, die zwar das gesamte, von einer 100 W-Halogenlampe emittierte sichtbare Licht über den Kollektor in den Kondensor bringt, jedoch jeglichen Infrarotanteil ausblendet. Das Präparat wird also nicht durch die Beleuchtung erhitzt und kann damit über lange Zeiträume beobachtet werden. Im Beleuchtungsstrahlengang befindet sich ein variables Graufilter, durch das die Intensität variiert werden kann, ohne dass der Lampenstrom – und damit die Farbtemperatur – verändert wird.

Abb. 5: Dunkelfeld-Mikroskop mit Kaltlichtquelle und Lichtleiter im Stativ.

Dunkelfeld-Mikroskop mit Kaltlichtquelle und Lichtleiter im Stativ.

Das abgebildete Mikroskop verfügt darüber hinaus noch über einen Kameraausgang am Beobachtungstubus, so dasss der Heilpraktiker nach Anschluss einer Kamera das mikroskopische Bild des Nativblut-Präparates auch unkompliziert dem Patienten auf einem Monitor zeigen kann.

Das Ergebnis: Dunkelfeldaufnahmen von Nativblut-Präparaten
Nach der Anfertigung des Nativblut-Präparates sollte zunächst der Kondensor mit dem 10:1-Objektiv gemäß der Bedienungsanleitung des Mikroskops zentriert werden. Anschließend wird ein Tropfen Öl auf das Deckglas des Präparates gegeben, das 100:1-Objektiv durch Drehen des Revolvers in den Strahlengang geschwenkt und mit dem Öltropfen in Kontakt gebracht (Abb. 4). Nach Auswahl einer geeigneten Präparatstelle und korrekter Fokussierung wird die Irisblende am Objektiv so weit geschlossen, dass sich optimaler Kontrast zwischen hellen Strukturen und dunklem Hintergrund einstellt.

Abbildung 6 zeigt ein bei den optimalen Einstellungen erhaltenes Dunkelfeldbild mit dem oben beschriebenen Mikroskop. Abbildung 7 zeigt ein Bild einer anderen Stelle des gleichen Präparates. Es wurde mit dem gleichen (Video-) Kamerasystem, aber mit einem Dunkelfeldmikroskop aufgenommen, dessen Kondensor eine NA von lediglich 1,2 hat. Darüber hinaus ist bei diesem Gerät die Beleuchtung so aufgebaut, dass das Licht der Kaltlichtquelle über einen gebogenen Lichtleiter direkt in den Kondensor eingespeist wird.

 Dunkelfeldmikroskop mit Objektiv Plan
Abb.6:Nativblutpräparat, Dunkelfeldaufnahme. Dunkelfeldmikroskopmit Objektiv SPL 100/1,25 – 0,60 Oel und Dunkelfeldkondensor NA = 1,4.

Abb.7:Nativblutpräparat, Dunkelfeldaufnahme. Dunkelfeldmikroskopmit Objektiv Plan 100/1,25 – 0,60 Oel und Dunkelfeldkondensor NA = 1,2.

Das Bild des zweiten Mikroskops mit der kleineren Kondensor-NA ist deutlich flauer. Die Zwischenräume sind nicht wirklich dunkel, und über dem ganzen Bild scheint ein leichter Lichtschleier zu liegen. Insgesamt ist der Kontrast also viel geringer als in Abb. 6, die Beobachtung feiner Strukturen im Blutplasma ist beinahe ausgeschlossen.
In Abb. 8 ist eine Reihe von Mikroskopbildern dargestellt, bei denen gegenüber Abb. 7 die Irisblende am Objektiv sukzessive weiter geschlossen wurde. Hiermit sollte festgestellt werden, bei welcher Einstellung optimale Dunkelfeldbedingungen herrschen.

Es wird deutlich, dass bei weiter geschlossener Irisblende zwar der Kontrast aufgrund der Ausblendung störenden Streulichts prinzipiell größer wird, dass allerdings auch die allgemeine Helligkeit abnimmt. Im dritten Bild zeigt sich das durch einen höheren Rauschpegel, im vierten durch eine deutliche Abnahme der Helligkeit in den Objektstrukturen, die auch die Videokamera nicht mehr ausregeln kann. Darüber hinaus kommt die Auflösung in keinem dieser Bilder an die der Abb. 6 heran, die mit dem Dunkelfeldmikroskop mit höheraperturigen Kondensor erstellt wurde.



 Abb. 8: Wie Abb. 7, jedoch Irisblende am Objektiv von Bild zu Bild weiter geschlossen.

Fazit: Hohe optische Qualität = Gutes Dunkelfeld!
Für die Abbildungsqualität eines Mikroskops sind nur einige wenige Parameter seiner optischen Komponenten entscheidend. Der vielleicht zentralste ist dabei die numerische Apertur, die nicht nur die verfügbare Lichtmenge, sondern auch das Auflösungsvermögen bestimmt. Schon kleine Unterschiede in den Aperturen bedeuten große Unterschiede in den Öffnungswinkeln der (vom Kondensor) emittierten und (vom Objektiv) aufgenommenen Lichtkegel. Im Zusammenspiel von Kontrastierverfahren, Vergrößerung und numerischer Apertur entscheidet sich, ob ein Mikroskop für eine bestimmte Anwendung geeignet ist oder nicht. Ein Dunkelfeldmikroskop ist dabei stets auf hohe Kondensor-und Objektivaperturen angewiesen, damit das für die Nativblut-Analyse erzeugt Bild maximalen Kontrast bei höchster Auflösung zeigt.

Zur Illustration wurden zwei Dunkelfeldmikroskope mit verschiedenen Kondensoraperturen und Beleuchtungskonzepten verglichen. Obwohl der Unterschied in den numerischen Aperturen der beiden Geräte nicht allzu groß zu sein scheint, zeigen sich sehr deutliche Unterschiede in den mikroskopischen Bildern. Offensichtlich reichen bei den besonders günstigen Dunkelfeldmikroskopen die zur Verfügung stehenden Herstellkosten nicht aus, um ein System aufzubauen, das dem Diagnostiker ein kontrastreiches und gleichzeitig hochauflösendes Dunkelfeldbild eines Nativblut-Präparates liefert. Die Bilder sind flau, also kontrastarm, und bei dem Versuch, den Kontrast durch Schließen der Irisblende am Objektiv zu vergrößern, wird gerade das durch einen massiven Verlust an Auflösungsvermögen erkauft.

Es ist sicherlich richtig, dass der Diagnostiker sowohl mit einem teuren, als auch mit einem günstigen Dunkelfeldgerät „etwas sieht“. Er sollte nur dafür Sorge tragen, dass er auch all das sieht, was für eine sichere Diagnose zum Wohl seiner Patienten entscheidend ist. Und dafür ist eine hohe Qualität der verbauten Optik, deren Spezifikationen der Anwendung angemessen sind, immer noch der entscheidende Faktor.



Dieser Artikel wurde dankenswerter Weise von Herrn Dr. Jörg Haus (Fa. Hund) zur Verfügung gestellt.



Technische Grundlagen der Dunkelfeldmikroskopie (Seite: 3 von 3)

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