Exkurs: Grundlagen der mikroskopischen Abbildung


Exkurs: Grundlagen der mikroskopischen Abbildung

Ein Mikroskop ist ein optisches Gerät, das mit extrem hohen Vergrößerungen im wahrsten Sinne des Wortes mikroskopisch kleine Gegenstände für das Auge beobachtbar macht. Die Abbildung erfolgt zweistufig mit Mikroskopobjektiv und Okular: Das Objektiv entwirft im ersten Schritt ein reelles Bild des Objektes. Die Mikroskopoptiken sind nach international gültigen Normen derart konstruiert, dass sich dieses Zwischenbild in einer Ebene 10 mm unterhalb des oberen Randes der Okularstutzen befindet. Mit einer Mattscheibe in dieser Ebene könnte das Zwischenbild sichtbar gemacht werden, es ist ein, wie der Optiker sagt, reelles Bild. Sein Durchmesser, die sogenannte Sehfeldzahl, beträgt z. B. 18 mm. Das Zwischenbild wird dann mit dem Okular wie mit einer Lupe weiter vergrößert und mit dem Auge betrachtet. Die Gesamtvergrößerung Mges des Mikroskops ergibt sich damit als das Produkt aus dem Abbildungsmaßstab des Objektivs Mobj und der Okularvergrößerung Mok:
Mges = Mobj • Mok

Beispiel:  
Mit einem 10x-Okular entsteht mit einem 40:1-Objektiv eine Gesamtvergrößerung von 10 • 40 = 400.
Über die Vergrößerung hinaus ist die numerische Apertur (NA) der entscheidende Parameter für die Qualität einer mikroskopischen Abbildung. Die numerische Apertur beschreibt zunächst das Lichtsammelvermögen des Objektivs, denn der zugehörige Formelausdruck enthält den (halben) Öffnungswinkel des Lichtkegels, den das Objektiv aufnehmen kann (Abb. 1):
NA = n • sinα
Das Symbol n steht hierbei für den Brechungsindex des Mediums zwischen Präparat und Objektiv. Da der Sinus höchstens 1 werden kann, ist für Luft (n = 1) der Höchstwert der NA ebenfalls 1. Er wird allerdings nicht erreicht, da dann die Randstrahlen des Lichtkegels senkrecht zur optischen Achse verliefen (α = 90°).

Beispiel:    
Befindet sich Luft zwischen Objektiv und Präparat, ist also n = 1, und hat der Lichtkegel, den das Objektiv „sieht“, einen Öffnungswinkel von 60°, d. h. α = 30°, dann ist NA = 0,5.

Abb. 1: Die numerische Apertur beschreibt den Lichtkegel, den das Objektiv aufnehmen kann.

numerische Apertur

Nimmt sie zu (rechts), steigt das Auflösungsvermögen des Objektivs. Große numerische Aperturen erfordern den Einsatz von Immersionsöl.

Grundsätzlich gilt, dass umso mehr Licht aufgenommen werden kann, je größer die NA ist. Große numerische Aperturen bringen jedoch ein Problem mit sich: Wenn der Einfallswinkel der Lichtstrahlen in das Objektiv zu groß wird, kommt es für stark geneigte Randstrahlen an den Grenzflächen der Optik zur Totalreflexion. Das Licht wird dann vollständig aus dem Strahlengang herausreflektiert, und diese Strahlen wären mikroskopisch nicht nutzbar. Das kann dadurch verhindert werden, dass zwischen Objektiv und Präparat ein Medium mit einem Brechungsindex größer als 1 eingebracht wird. Damit ist der Brechungsindexsprung geringer, und die Randstrahlen können weiter in Richtung Okular laufen. Man spricht in diesem Fall von einer Immersion des Objektivs, die für gewöhnlich mit einem speziellen Öl mit einem Brechungsindex von n ≈ 1,5 erfolgt.

Beispiel:    
Befindet sich Immersionsöl zwischen Objektiv und Präparat, also n = 1,5, entspricht eine Objektivapertur NA = 1,25 einem Winkel α von 56°, so dass der Öffnungswinkel des Lichtkegels 112° erreicht.

Die Eigenschaften des durch die Mikroskopbeleuchtung zur Verfügung gestellten Lichtes werden ebenfalls von dem Kondensor bestimmt. Da er ursächlich den Lichtkegel formt, aus dem das Objektiv einen Teil aufnimmt, wird auch seine numerische Apertur das Auflösungsvermögen des Mikroskops beeinflussen. Um jetzt doch noch einen Formelausdruck zu bemühen: Das Auflösungsvermögen des Mikroskops wird charakterisiert durch den kleinsten Abstand Δx zweier Punkte, die gerade noch aufgelöst, d. h. getrennt wahrgenommen werden können. Ist weiterhin λ die (mittlere) Wellenlänge des im Mikroskop verwendeten Lichts, dann gilt mit NAObj, der numerischen Apertur des Objektivs, und mit NAKond, der numerischen Apertur des Kondensors:
Δx = λ /(NAObj + NAKond)

Das ist die berühmte Formel für das Auflösungsvermögen eines Mikroskops nach Ernst Abbe (1840 -1905), durch die erst eine industrielle Fertigung von Mikroskopen gleichbleibender Qualität möglich geworden ist. Für den Kondensor gilt wie für das Objektiv, dass numerische Aperturen > 1 nur mit einer Ölimmersion erreicht werden können.

Beispiel:    
Bei Verwendung von (weißem) Halogenlampenlicht wird als mittlere Wellenlänge λ = 0,55 µm angenommen. Mit einem 100x-Objektiv mit NAObj = 1,25 und mit einem (Dunkelfeld-) Kondensor mit NAKond = 1,4 wird Δx = 0,21 µm.

Doch wie hängen diese Größen zusammen? Wäre es z. B. möglich, mehr Details eines Objekts zu erkennen, wenn die Vergrößerung weiter gesteigert wird? Die Situation ist vergleichbar mit einem Fernsehgerät, dessen Bild aus einzelnen Bildelementen (Pixeln) zusammengesetzt ist. Aus einiger Entfernung können diese Strukturen nicht erkannt werden, und mit abnehmendem Abstand zum Fernsehschirm werden tatsächlich mehr Details sichtbar. Wird allerdings eine bestimmte Grenze unterschritten, fällt die Pixelstruktur deutlich auf, die bisher sichtbaren Details werden dann zwar größer, jedoch nicht zahlreicher. Für das Mikroskop bedeutet das, dass Vergrößerungen, die größer als die sogenannte „förderliche“ Vergrößerung sind, nicht mehr zu größerem Detailreichtum des Bildes führen: Sie werden als „leere“ Vergrößerungen bezeichnet. Für den Bereich der förderlichen Vergrößerung eines Mikroskops gibt es eine Faustregel: Ist NAObj wieder die numerische Apertur des Objektivs, ist der Bereich der förderlichen Vergrößerung Mförd:

Mförd = (500 … 1000) x NAObj

Beispiel:    
Für ein 100:1-Objektiv mit NAObj = 1,25 liegt die maximale förderliche Vergrößerung bei 1000 x 1,25 = 1250. Die maximale Vergrößerung der Okulare darf dann 1250 / 100 = 12,5 nicht überschreiten, wenn der Bereich der förderlichen Vergrößerung nicht verlassen werden soll.
Immer wieder werden Mikroskope mit Gesamtvergrößerungen von bis zu 18000 angeboten. Wir wissen jetzt, dass es sich dabei nur um leere Vergrößerungen handeln kann, die etwa dadurch zustande kommen, dass das Bild auf einem möglichst großen Monitor dargestellt wird.
Die beschriebenen Parameter finden sich neben anderen als Aufdruck auf den Mikroskopobjektiven wieder (Abb. 2).

Abb. 2: Planachromatische Objektivreihe.

Planachromatische Objektivreihe

Der erste Ausdruck bezeichnet den Korrektionszustand. Üblicherweise handelt es sich bei den Objektiven um Achromate, bei denen unerwünschte Farbfehler aufgrund der für rotes und blaues Licht unterschiedlichen Brechungsindizes, die sogenannte chromatische Aberration, auskorrigiert sind. Wird zusätzlich noch eine dritte Wellenlänge im grünen Spektralbereich hinzugenommen, werden diese Objektive als Apochromate bezeichnet. Diese (sehr teuren) Objektive garantieren geringste Verfälschungen des Bildeindrucks aufgrund verschiedener Lagen der Bilder für die unterschiedlichen Wellenlängen. Der Aufdruck „Plan“ bedeutet, dass zusätzlich zur chromatischen Korrektur die Bildfeldwölbung korrigiert ist. Bei Achromaten ist üblicherweise ein begrenzter Bereich um die Bildmitte herum scharf, während es zum Rand des Bildes hin allmählich unscharf wird. Da der Mikroskopiker häufig ohnehin den interessanten Präparatausschnitt in die Mitte bewegt, reichen diese Objektive oft aus. Soll das Bild allerdings über seinen gesamten Durchmesser scharf sein, ist eine Korrektur durch zusätzliche optische Elemente notwendig, die im Ergebnis zu sogenannten Planachromaten führt. Diese Objektive sind allgemein teurer als Achromate mit ansonsten gleichen optischen Parametern. Daneben gibt es auch noch Semiplanachromate, bei denen der Durchmesser des scharfen Bildbereiches zwischen dem der Achromate und dem der Planachromate liegt.

Die folgende Zahl bezeichnet die Objektivvergrößerung. Sie ist zusätzlich durch einen farbigen Ring kodiert, dessen Farbe – genauso wie die gesamte Bedruckung des Objektivs – genormt ist. Die Zahl hinter dem Schrägstrich bezeichnet die NA. In der Zeile darunter steht zunächst die sogenannte Tubuslänge, die nach DIN ISO 9345-1 160 mm beträgt. Bei ihr handelt es sich um den Abstand zwischen der Anschraubfläche der Objektive am Objektivrevolver und der Anlagefläche des Okulars. DIN ISO 9345-2 beschreibt daneben Mikroskope mit der häufig erhältlichen Tubuslänge unendlich. Sie wird mit dem Symbol „“ gekennzeichnet und kommt dadurch zustande, dass die Lichtstrahlen das Objektiv (nahezu) parallel verlassen, so dass das Zwischenbild (fast) im Unendlichen liegt. Zur Betrachtung mit den Okularen muss das Zwischenbild allerdings wieder mit einer Tubuslinse aus dem Unendlichen zurückgeholt werden, damit überhaupt ein Zwischenbild entsteht. Vorteil des parallelen Strahlenganges ist seine Unempfindlichkeit gegenüber weiteren dort eingebrachten optischen Elementen, die optische Bildqualität ist aber prinzipiell mit der eines Mikroskops mit 160 mm Tubuslänge vergleichbar. Um Missverständnisse auszuräumen: Der Anwender sieht das mikroskopische Bild für beide Tubuslängen im Unendlichen und kann dadurch entspannt beobachten, die Tubuslänge ist lediglich ein interner optischer Parameter von dem er oder sie nichts mitbekommt! Die Zahlenangabe hinter der Tubuslänge ist die Deckglaskorrektur: Üblicherweise werden mikroskopische Präparate mit Deckgläsern mit einer Stärke von 0,17 mm abgedeckt. Diese Deckgläser müssen in den optischen Strahlengang eingerechnet werden, damit sich keine optischen Verzerrungen ergeben. Der Einfluss des Deckglases wird umso stärker, je größer die numerischen Aperturen werden, also je steiler die Lichtstrahlen durch das Präparat verlaufen. In der Regel kann davon ausgegangen werden, dass Objektive mit Abbildungsmaßstäben von 4:1 und 10:1 auch ohne Deckglas verwendet werden können, für höhere Vergrößerungen werden für das Arbeiten ohne Deckglas spezielle Objektivkonstruktionen notwendig.




Technische Grundlagen der Dunkelfeldmikroskopie (Seite: 2 von 3)

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