Mikroskopietechnik Teil1 Lothar Fischer MST-Mikroskoptechnik

(Beitrag vom 27.05.2004 korrigiert am 19.05.2015)

Mikroskopietechnik (Teil1)

Einleitung:

Um zu erklären,  was Mikroskopie ist, kann man wie das immer im Leben so ist, mehrere Wege einschlagen.
Wir wollen einen verständlichen und auch technisch nachvollziehbare Darstellung versuchen und sagen einfach: 
Mikroskopie ist eine Technik mit der Dinge, die mit bloßen Augen nicht mehr zusehen sind, bildhaft sichtbar gemacht werden.

Die Betonung liegt dabei auf bildhaft, denn nicht das Ding oder der Gegenstand, den wir eben nicht mehr erkennen können, weil er für unser Auge zu klein ist,  wird sichtbar gemacht, sondern nur dessen Bild und das in einem vergrößertem Abbildungsmaßstab.
Damit  liegen auch alle für diese Sache wesentlichen Schwierigkeiten, Probleme und Fragestellungen und natürlich auch alle wissenschaftlichen Lösungsansätze in diesem Sachverhalt  – denn wir sehen ja nur ein Bild eines Objektes !

Bekanntlich können ja Bilder sehr einfach manipulieren werden – die einfachst Art der Manipulation und das hat wohl schon jeder schon einmal selbst erleben können ist, wenn man das Objekt, welches man bildhaft darstellen möchte ( z.B. Fotografie; Videoaufnahme ),  mit unterschiedlich farblichen Licht oder einfach mit nur zu wenig oder zuviel Licht beleuchtet wird! plötzlich erscheint das Bild des Objekt in einem ganz anderen Licht, die Farben verändern sich, Details verschwinden oder werden betont und auch geometrischen Verhältnissen scheinen sich zu verändern.

Mit der Erkenntnis, dass man mittels geschliffener Gläser, Dinge genau diese tun und dabei auch noch deren Größenverhältnisse verändern kann , in diesem Moment  war die Stunde der Mikroskopie gekommen.
Wer es genau war, der das so angewandt, gesagt oder getan hat ist nicht  bekannt.  Aber seit  ca. Ende ausgehendes Mittelalter haben sich eine Menge kluger Leute damit beschäftigt, die für den Menschen nicht erkennbare Welt, erkennbar und damit begreifbar zu machen. 
Im Wissensdrang der Menschheit , immer mehr und umfassender unserer Welt zu entdecken und zu verstehen, in diesem Prozess kommt der Mikroskopie eine Schlüsselposition zu.


 

Mikroskopiermethoden

Grundsätzlich strukturiert sich die Mikroskopie in

  • Auflichtmikroskopie
  • Durchlichtmikroskopie

Der wesentlichste Unterschied ist, wie aus dem Namen hervorgeht, die Art der Beleuchtung des zu betrachtenden Objektes.
Bei der Auflichtmikroskopie wird das Objekt  von oben her beleuchtet und das Mikroskop blickt auf das so beleuchtete Objekt.  Bei der Durchlichtmethode wird das Licht durch das zu betrachtende Objekt  geschickt und das Mikroskop blickt genau in diese Licht.
Auflichtmikroskopie wird hauptsächlich für Dinge angewendet ,wie Oberflächen oder Dinge die man mit noch geringen Vergrößerungsfaktoren bildhaft darstellen kann.
Bei Durchlichtmethoden können hohe Vergrößerung  bis  1000 fach und mehr erreicht werden aber in praxi  werden Vergrößerungen im Bereich von 100 bis 500x  hauptsächlichst genutzt. Ursache ist einerseits die Tatsache, dass mit steigender Vergrößerung das Bildfeld des zu betrachtenden Objektes immer kleiner wird und andererseits die Objektausleuchtung immer problematischer wird , ja sogar ab bestimmten Vergrößerungen in solche Bereiche vorstößt
wo nicht mehr eindeutig zugeordnet werden kann, ob man nun das Objekt noch betrachtet oder schon Phänomene des Lichtes zur Abbildung beitragen. Hier kommen dann andere Mikroskopiermethoden, wie die Elektronenstrahl - mikroskopie zu Einsatz.

In der Durchlichtmikroskopie gibt es nun eine Menge von Methoden, wie man bestimmte Objekte vernünftig abbilden kann.  Diese Methoden haben sich in den jeweiligen Wissenschaftsbereichen, in der Technik in  der Medizin entwickelt und spezialisiert.  Der wissenschaftliche Gerätebau  besondere durch Zeiss hat hier geschichtlich und auch aktuell gesehen die technischen Voraussetzungen geliefert, die durch die jeweilige Mikroskopieraufgabe gestellt wurde.
Die Dunkelfeldmikroskopie ist hier genauso wie z.B. die Fluoreszenz – Mikroskopie zu nennen.   

Neben der optisch –gerätetechnischen Basis kommt der Beleuchtung und der Manipulation der Präparate also der zu betrachtenden Objekte durch Aufbereitung ( z.B. zytologische Schnitte ) Einfärbungen und sonstigen chemisch-physikalischen Manipulation eine wesentlich Bedeutung  zu.
Dabei wird Beleuchtung in der Regel direkt dem Mikroskop  zu geordnet.


Dunkelfeldmikroskopie

Die Dunkelfeldmikroskopie ist eine Methode aus dem Spektrum der Durchlichtmikroskopie.
In der Regel werden hier Präparate mit geringen oder schwachen, farblichen und geometrischen Strukturen untersucht.  Die Detaildifferenzierung diese Präparate ist schwach ausgeprägt und möglicherweise in hohen Vergrößerungsbereichen erst eindeutig sichtbar. Mit Dunkelfeld kann man an der Grenze der sogenannten förderlichen Vergrößerung mikroskopieren , weil durch den Einsatz von speziellem Mikroskopieröl, dem   Immersionsöl,  zwischen dem Präparat und dem Objektiv  eine Vergrößerung der numerischen Apertur des zum Einsatz gebrachten  Objektivs erreicht wird – oder anders:  das Bild wird nicht durch Luft (Brechnungsindex 1)  sondern durch Öl (Brechnungsindes 1.515 oder größer ) übertragen und damit  wird eine Betrachtung in einer höheren Vergrößerung effektiv möglich.
Will man  das Prinzip der Dunkelfeldmikroskopie erklären, kommt für die Bezeichnung Bildes inverses - oder Negativbild am ehesten in Frage.
Das Licht wird in einem speziellen Kondensor von seiner geradlinigen Ausbreitungsrichtung so abgelenkt, dass es gesehen zum Präparat  in einem schrägen Einfallswinkel eintritt.  Dieser schräge Lichteinfall kann durch Immersionsöl noch verstärkt werden. Blickt nun das Objektiv auf das Präparat so wird diese Negativbilddarstellung sichtbar. Voraussetzung ist, dass der schräg in das Präparat eingefallen Lichtstrahl nicht  in das Objektiv eintreten kann. Die zum Einsatz kommenden Objektive müssen damit in ihrem Lichteinfallsbereich (Öffnung ) speziell begrenzt
sein – dies gilt besonders für den Vergrößerungsfaktor 100x;  Objektive  unter 100x sind in der Regel immer ausreichend begrenzt .

Aus dieser  technisch - und optischen Konzeption ergeben sich eine Reihe von Anforderungen, an diese Mikroskopiermethode, die diese Methode elitär gestaltet  und damit in seiner Anwenderbreite neben der Tatsache der Aufgabenzuordnung hervorhebt.


Mikroskop und  Anforderungen aus der Dunkelfeldmikroskopie

Das Mikroskop, also die Technik  mit der man solche Dinge, die man nicht mehr mit bloßem Auge erkennen kann, sichtbar gestaltet also vergrößert und als Bild darstellt , ist im einfachsten Sinne eine Lupe, die in mehrer Funktionsbereichen aufgeteilt ist.  Durch die Eigenschaft des Glases, Licht zu brechen, werden durch das Zusammenspiel zwischen Objektiv und Okular diese  Vergrößerung erzielt. Die Geometrie der in diese "Lupe" zum Einsatz kommenden Gläser und die Glasart  ermöglichen dann verschiedene Vergrößerungen.
Die Bildqualität ist dabei hauptsächlich abhängig vom Qualitätsstandard der eingesetzten Objektive, der Art und der Qualität der Beleuchtung und vom mechanisch optischen Zusammenspiel aller Komponenten im Mikroskop.
Die Erfahrung und das Können des Bedieners kommt dann letztendlich dazu !
Dunkelfeldmikroskopie kann als ölimmersiv oder auch trocken durch geführt werden . Diese Entscheidung ist abhängig von der Art des eingesetzten Kondensors. Generell werden mit der ölimmersiven Verfahrensweise  bessere Bildqualitäten erreicht und außerdem kann nur mit diesem Verfahren ein Objektiv mit Vergrößerungsfaktor 100x  eingesetzt werden.
    
Vergrößerung

Die Vergrößerungen, die mit einem Durchlichtmikroskop /Dunkelfeld eingestellt  werden  können ergerben sich aus der Multiplikation der Okularzahl ( die erste Zahl der Gravur , z.B.:  10 x  ....   ) mit der Objektivzahl (  die erste Zahl der Gravur, z.B.: 40/....  ).
Für die Blut - Mikroskopie im Dunkelfeld haben sich folgende Vergrößerungen bewährt:
1.  Objektiv   10/ mit Okular 10x  =   100
2.  Objektiv   40/ mit Okular 10x  =   400
3.  Objektiv 100/ mit Okular 10x  = 1000
Höhere Vergrößerung sind nur über die Erhöhung der Okular zahl möglich, wie z.B. 12,5x  oder 16x . Mit größerer werdender Okularzahlen reduziert sich Bildkreisdurchmesser und auch die Beleuchtungsstärke.
Aber all das ist nicht die eigentliche Begrenzung nach oben, sondern das Licht selbst begrenzt die nutzbare Vergrößerung.  Es gilt das Produkt aus Objektivzahl und Okularvergrößerung soll das 1000fache der numerischen Apertur ( die zweite Zahl der Gravur auf dem Objektiv, z.B.:  ..../ 1,40 ...) nicht überschreiten , weil dann schon Objekte sichtbar sind dessen Dimensionen kleiner sind als die Wellenlänge des grünen Lichtes ( grünes Licht = 500 nm ).

Bei  Dunkelfeld kann diese Grenze sehr aus genutzt  werden, da der genutzte Spektralbereich des Lichtes seinen Schwerpunkt  in Richtung rot hat und außerdem durch den Einsatz von Immersionsöl, das einen höheren Brechnungsindex als die üblicher Weise genutzte Luft aufweist.
Zusätzlich gilt noch für jeden Mikroskopiker, eher mit geringeren Vergrößerungen zu arbeiten.

Beleuchtung

Der Beleuchtung kommt ,wie schon erwähnt,  eine hervorragende Bedeutung zu.
Für Dunkelfeld werden sogenannte Dunkelfeldkondensoren eingesetzt. Diese lenken den Lichtstrahl, der von einer Lichtquelle ausgeht und normalerweise senkrecht durch das Präparat und dann direkt in das Objektiv ohne Richtungsveränderung eintritt, so ab, dass das Licht schräg durch das Pärparat läuft und dann eben nicht mehr in das Objektiv einfallen kann. Das Objektiv betrachtet dann nur noch das durchleuchtete Präparat.
Damit wird schon deutlich , dass gegenüber anderen Durchlichtverfahren enorm viel Licht benötigt wird, um mikroskopischen Untersuchungen bei hohen Vergrößerungen vornehmen zu können. Entscheidend ist aber nicht die Lichtausbeute an der Lampe, sondern die Menge Licht die durch das Präparat streift . Solchen Kondensoren, die die Lichtstrahlen ablenken und nicht ausblenden (Kardioid - Systeme) ist hier der Vorzug einzuräumen.
Die Farbe des Lichtes also der Einsatz von Filtersystemen hat bei der Dunkelfeldmikroskopie eine sehr  untergeordnete Rolle.
In der Blutanalyse mittels Dunkelfeld ist in der Regel der Einsatz von Filtergläsern nicht vorgesehen.

Mechanik

Das Zusammenspiel zwischen Objektiv und Okular wird über eine hochwertiges mechanisch hochgenaues Stativ realisiert. Die durch die Optik vorgegebenen Abstände , Durchmesser und  Planlagen müssen exakt eingehalten werden und der Tisch auf dem dann das zu untersuchende  Präparat auf gelegt wird, muß exakt im rechten Winkel zum optischen Strahlengang stehen, sodaß auch beim seitlichen verschieben des Tisches die jeweiligen bildhafte Einstellung erhalten bleibt.
Dieser Anspruch klassifiziert die Mikroskope deutlich.

Handhabung

Da die Dunkelfeld eine Spezialdisziplin der Durchlichtmikroskopie ist und da hier mit Ölimmersion  gearbeitet werden muß , wird ein anspruchsvolles Maß an Mikroskopierfertigkeit gestellt.
Zwischen Kondensor und Präparat wird Öl gesetzt und  ab definierten Vergrößerungen muß dann noch zwischen Objektiv und Präparat geölt werden. Das Öl ist damit Hilfsmittel und gleichzeitig auch die Verschmutzungsursache schlecht hin. Ein sauberes und konzentriertes Arbeiten ist Bedingung.

Mikroskopsysteme im Vergleich

Grundsätzlich sollte nach den vorgestellten Zusammenhängen die Gesamtqualität eines Mikroskops und hier speziell für den Einsatz im Dunkelfeld  beurteilt werden.
Natürlich sind neben den physikalisch optischen Grundlagen noch die Fertigung von Mikroskopen
mit zu betrachten.
Also : das Know How und die technische  Realisierung nach diesen Kriterien ergeben sich folgende groben Beurteilungsschema    

Know-How oder Basistechnologie:

Es gibt in der Mikroskopie (Optik)   neben den bereits dargestellten individuellen und systematischen Qualitäten 2 Grundprinzipien:

  • unendlich korrigierte Optik
  • endlich korrigierte Optik

Endliche System sind gleichbedeutend mit denen der klassischen Mikroskopoptik,  also die, die seit bestehen der Mikroskopie entwickelt und gebaut worden sind.
Hauptmerkmal diese Optik sind begrenzte Tubuslängen von 150 mm , 160 mm oder auch andere , oder anders ausgedrückt:  man muß immer seine Augen auf die Nähe anstrengen, um das Bild im Okular zu sehen .  

Unendliche System haben Tubuslängen in der Größenordnung von 760 mm – oder anders; die Augen müssen nicht mehr auf Nahdistanz (wie beim Lesen) angestrengt werden.  Die Vorteile liegen damit sofort auf der Hand:

  • ermüdungsfreies Arbeiten
  • hohe Bildqualitäten
  • große Bildfelder mit nahezu konstanter Brillanz über das gesamte Bildfeld
  • homogene Ausleuchtung

Die technischen Aufwendungen für derartigen Optiken sind wesentlich größer, als die bei den klassischen Systemen, also bei den endlich korrigierten Optiken.

Unendlich korrigierte Mikroskope werden von Zeiss, Olympus, Nikon und Leica angeboten. Entwickelt wurde das Prinzip bei Zeiss.
Endlich korrigierte Mikroskope werden sowohl von den eben genannten Unternehmen als auch von einer Vielzahl anderer Firmen ( Hund, MST, Euromex ........)  weiterhin hergestellt und vertreiben.

Abbildungstechnologie/Objektive


Es gibt 3 Objektiv - Klassen:

  • 1. Klasse.  Achromate:     
    Farbe ist korrigiert
  • 2. Klasse.  Plan-Achromate:  
    Farbe und Geometrie ist korrigiert
  • 3. Klasse.  Apo-Plan-Achromate:
    mehrfache Korrekturansrengungen in Farbe und  Geometrie

Zwischenstufen sind z.B. die sogenannten:  Semi-Planachromate (zwischen 1. und 2.)

Diese Klassifizierung bezieht sich auf die Gestaltung der Objektive im Bezug auf deren Abbildung der realen Wirklichkeit also der zu betrachtenden Objekte  - gesehen über das gesamte Bildfeld,  welches dann die Okulare betrachten !

Lichttechnologie/Kondensoren

In Dunkelfeld bildet, wenn man davon ausgeht, das die Objektive, Okulare und auch die Mechanik gleich gut bei allen Mikroskopen wäre, das Kondensorsystem das entscheidende Qualitätskriterium. Hier wird die Grundlage für die Qualität des Dunkelfelddarstellung gelegt.
Mit echten Kardioiden (Dunkelfeldkondensoren) wird ein besseres Bild erzeugt, als mit Ausblendsysteme.


Know-How / Handhabung

Die Reproduzierbarkeit der Einstellung ist eine der Hauptbedingung für die Dunkelfeld-Mikroskopie.
Die Handhabung und die mit der Anlieferung eines Mikroskops verbundene Einweisung /Schulung sollte für den Kunden ein wesentliches Entscheidungskriterium für oder gegen ein Mikroskop sein.


Weiter zum Teil2 Mikroskopietechnik

 


Lothar Fischer
MST MicroSystemTechnik GmbH


 

 


 


Seite zurück